Estudos de associação genômica ampla para o resto de nós: mesa-redonda 2

[0:00] [Dra. Teri Manolio] Então, novamente, enquanto as pessoas estão meio que metabolizando o café e tal, David, seria interessante ouvir um pouco mais, se você puder expandir um pouco, sobre essa questão da escolha de controles. E eu sei que houve alguma discussão no intervalo de que realmente deveríamos estar pensando seriamente sobre controles de conveniência e como se faz isso, então pode haver outros que queiram falar sobre isso. Mas em termos dos controles de conveniência que foram feitos até agora, você pode falar um pouco mais sobre quais poderiam ser os pontos fortes e fracos deles?

[0:31] [Dr. David Hunter] Então eu acho que os pontos fortes são que, você sabe, essas são amostras em larga escala, e muitas vezes não temos, para um determinado fenótipo, estudos que sejam tão grandes quanto 3,000 controles. No exemplo do Wellcome Trust, você sabe, podemos ter o melhor estudo de caso para uma doença mais rara de apenas algumas centenas. Então, nesse contexto, provavelmente o melhor conselho seria genotipar os controles que você tem que atendem aos métodos epidemiológicos de melhores práticas, mas esteja ciente de que pode haver outras populações que você pode importar para essencialmente aumentar seu número de controles.

[1:11] E isso lhe dará alguma capacidade limitada de comparar a prevalência alélica no desenho de melhores práticas com os controles in silico. E a outra questão que Elizabeth levantou é que, à medida que as plataformas mudam, o significado desses controles in silico vai mudar. Então, à medida que você passa de 100k para 317k para 550k e importa esses grupos controle, você terá um subconjunto de SNPs que não estão representados nesses controles. Então, novamente, eu acho que se for possível, você sempre gostaria de ter alguns dos seus próprios controles, só para poder comparar um pouco a prevalência, reconhecendo que você não terá o máximo de poder estatístico de forma alguma.

[1:49] [Dra. Teri Manolio] Debbie. [Dra. Deborah Nickerson] Sim, eu acho que também é realmente importante pensar em comparar suas frequências alélicas com o HapMap e com os outros controles que possam existir, porque eles apontam algumas métricas de qualidade, às vezes, que talvez você não conheça. A outra coisa que eu sugeriria, que achei interessante, é que a maioria dos estudos nem sequer genotipou o sexo. E uma das discrepâncias que encontramos ao trabalhar com indivíduos é a troca de amostras ao longo do tempo.

[2:25] E você realmente não sabe que elas existem, e na verdade apenas fazer um teste genético para sexo entre suas amostras mostrará onde pode ter havido um pequeno lote que entrou e as pessoas -- anos atrás, inverteram tubos, e isso simplesmente continuou no seu estudo ao longo do tempo. Então, na verdade, fazer alguns objetivos no seu estudo e alguma indicação do sexo das suas amostras ajudará você a avançar com alguns desses estudos em larga escala, porque você tem uma ideia da qualidade e integridade das suas amostras.

[3:05] [Dra. Teri Manolio] Esses são pontos excelentes, Debbie, e eu acho que David pode dar exemplos de estudos de câncer de mama em que homens inesperados foram incluídos, e estudos de câncer de próstata em que mulheres inesperadas foram incluídas, e surtos de gêmeos em amostras duplicadas, e -- [Dr. David Hunter] Na verdade, isso faz um ponto muito bom: as plataformas agora são tão boas, você sabe, não para cada SNP, mas de modo geral, as taxas de conclusão são de 99 por cento, as taxas de concordância em 99.5 por cento, que a maior fonte de erro pode ser esse repositório em outras áreas. E então ter uma impressão digital muito cedo na vida da amostra -- as pessoas costumavam usar os microssatélites, agora as pessoas parecem muito satisfeitas com um sequenomyoplex [soletrado foneticamente] de cerca de 30 SNPs, algo assim.

[3:45] Ter uma impressão digital muito cedo no estudo permite rastrear esses erros se alguém virar uma placa de cabeça para baixo. Existem outras maneiras de detectar isso, mas você detecta sem ambiguidade se algumas amostras forem trocadas se tiver uma impressão digital esperada desde muito cedo na vida da amostra. [Dra. Teri Manolio] Microfone da frente, por favor. [Palestrante feminina] Muito obrigada por um dia realmente interessante até agora. E eu tenho uma pergunta relacionada a um ponto que Elizabeth fez. Eu acho que é realmente importante que os genótipos sejam na verdade fenótipos eles mesmos, e eles na verdade não são -- eles não são categóricos; eles são na verdade apenas duas intensidades alélicas quantitativas, e eu me pergunto -- é uma questão técnica e estatística -- se as pessoas estão começando a olhar para usar isso como medida de exposição, e se alguém tem experiência em estudos com isso.

[4:36] [Dra. Teri Manolio] Essa é uma pergunta realmente interessante. Esta é uma daquelas perguntas, você sabe, que poderia ser pursued em conjuntos de dados. Eu não sei se há muito disso, e talvez alguns dos genomicistas do grupo possam comentar. Houve algumas explorações interessantes, você sabe, de amostras que falham na amplificação de genoma completo, por exemplo. Há certas características das pessoas que falharão nisso e que podem se agrupar em famílias, então pode haver genes relacionados a isso. Debbie, você gostaria de comentar se esses fenótipos -- os genótipos variantes que se vê a partir deles são de alguma forma possíveis de usar como desfechos?

[5:12] [Dra. Deborah Nickerson] Você pode usá-los. E, na verdade, a variação do número de cópias é uma ótima maneira. Isso foi encontrado por agrupamento estranho. Então, olhando para esses genótipos atípicos que você obtém onde vê múltiplos clusters, e na verdade as pessoas estão encontrando essas diferenças. Por exemplo, em algumas dessas plataformas, elas estão genotipando sobre SNPs desconhecidos, e isso causa, na verdade, quatro clusters ou cinco clusters ocorrerem.

[5:43] E você está obtendo informações de genótipo sobre esse SNP desconhecido e pode voltar e explorar essas informações. Elas podem ser descartadas. Então, eu acho que na verdade olhar para algumas dessas coisas é realmente importante. Mas elas não são a primeira coisa que você olha, certo? [Dra. Teri Manolio] Bom ponto. Mike? [Mike] Sim, obrigado pelas duas ótimas palestras. Então esta é uma pergunta sobre projetos de meta-análise, e o efeito de usar diferentes plataformas em estudos em uma meta-análise.

[6:15] Eu gostaria de ouvir mais sobre isso. E também, a escolha diferente de grupos de controle nos estudos em uma meta-análise, e como isso pode realmente fazer você hesitar em alguns desses projetos de meta-análise. [Dr. Teri Manolio] Então, talvez Elizabeth -- você poderia comentar sobre as diferentes plataformas? [Dr. Elizabeth Pugh] Posso comentar um pouco, e acho que Laura Scott provavelmente falará sobre isso um pouco mais tarde. Realmente depende de como você está conduzindo sua análise. Há diferentes SNPs em cada uma dessas plataformas. Então, se você está combinando dados onde você tem diferentes SNPs nos dois estudos, então você terá que inferir os genótipos a partir da outra plataforma, ou calcular haplótipos usando os SNPs de ambos, e usar os haplótipos, não os SNPs individuais, ou olhar para a ligação a uma região e ver se -- ou associação a uma região ou haplótipo específico.

[7:06] Então, isso torna sua análise um pouco mais complexa, mas é certamente possível, e há vários grupos por aí que fizeram isso com muito sucesso. Então, não é tão crítico quanto as pessoas pensavam que poderia ter sido alguns anos atrás ter exatamente o mesmo produto e exatamente os mesmos SNPs, porque vários grupos mostraram que é muito possível fazer a análise; é apenas outro desafio técnico ao longo do caminho. [Dr. Teri Manolio] E Laura provavelmente comentará também, mas certamente nos estudos de diabetes, aqueles três estudos de diabetes que mostrei, quando quiseram combinar seus dados, estavam combinando entre as plataformas Affymetrix e Illumina, e usaram algoritmos de imputação para fazer isso.

[7:43] Acho que uma das lições principais disso é que os algoritmos de imputação são realmente muito bons, mas não são perfeitos, como nada é. E uma vez que se olha para uma imputação e se vê que parece muito boa, você realmente tem que voltar e genotipar o SNP que está inferindo. Então -- [Dr. David Hunter] Apenas estando ciente, também, de que há lacunas nas plataformas, e então, acho que a função cognitiva é um dos grupos de doenças do Wellcome Trust, mas opa, não há um bom substituto para APOE4 naquela geração do chip Affy. E você sabe, você pode obter essas impressões onde há um anexo infomático de um nome de gene para os números RS, mas se você está realmente atrás de um SNP muito específico, você realmente tem que confirmar que há algo em bom LD com ele.

[8:24] [Dr. Teri Manolio] E acho que sua segunda pergunta, Mike, era para David. Você pode querer repeti-la se -- [Mike] Isso é sobre a variação nos grupos de controle em estudos em uma meta-análise. [Dr. David Hunter] Então, novamente, você sabe, não acho que haja muita evidência até agora de que estudos de caso-controle razoavelmente bem desenhados, comparados com estudos de caso-controle razoavelmente bem desenhados, comparados com controles hospitalares versus populacionais, estejam levando a respostas radicalmente diferentes ou mesmo perceptivelmente diferentes para esses SNPs mais fortes. Em uma meta-análise, no entanto, acho que você sempre iria querer, você sabe, rodar dentro de estratos definidos por design ou alguma medida de qualidade, apenas para confirmar isso.

[9:03] E à medida que chegamos a riscos relativos mais baixos, você esperaria que, se estivermos introduzindo qualquer ruído metodológico, isso tornaria mais difícil discernir aqueles. Mas, você sabe, acho que temos que estar cientes de que os motivos tradicionais de preocupação com certos designs relacionados a viés de informação e viés de seleção, você sabe, podem não ser tão prementes nesta área, se não houver relação entre taxa de participação e genótipo, etc. Então temos que ter cuidado, e provavelmente em uma meta-análise você quer estratificar.

[9:37] Mas até agora, acho que, você sabe, as preocupações que temos com dados autorrelatados e dados retrospectivos versus prospectivos, você sabe, podem não se aplicar com tanta força a esses estudos. [Mike] Obrigado. [Dr. Teri Manolio] E certamente quando eu era uma epidemiologista iniciante, eles nos disseram primeiro: tenha muito medo de estudos de caso-controle, o que não acho que foi um ótimo conselho, mas -- e também, se você for fazê-los, considere usar múltiplos grupos de controle. E uma das grandes vantagens, agora, do compartilhamento de dados e de bancos de dados como o CGEMS e outros, que têm suas frequências alélicas de controle amplamente disponíveis, é que você pode olhar para múltiplos grupos e ver: "Meu grupo de controle é de alguma forma comparável a esses outros, e se não, por quê?"

[10:16] E também, suas descobertas se sustentam? Vários dos desenvolvedores de plataformas estão na verdade desenvolvendo grandes bancos de dados de controle que estão tornando amplamente disponíveis. Então, a Illumina acabou de anunciar o deles, e esse irá para o dbGaP assim que alguns de nós fizermos o trabalho necessário para colocá-lo lá, incluindo eu mesma. Mas de qualquer forma, esses estarão disponíveis. Tem havido, por muitos anos, discussões sobre tentar obter as frequências genotípicas [ininteligível], porque essa é uma amostra nacionalmente representativa, em algum tipo de banco de dados acessível, e o trabalho está avançando nisso também.

[10:50] [Orador Masculino] Esta é uma pergunta básica. Como você define uma população? E então, segundo, quando os -- em alguns dos artigos que surgiram nos últimos dois anos, sabemos muito bem que diferentes populações, diferentes regiões do genoma sofrem diferentes pressões seletivas. Portanto, a história populacional difere da humana -- [ininteligível]. Então, quando juntamos essas coisas -- isto é, misturar populações e então ver o efeito dessas populações misturadas, e então a questão é: quais são as chances de encontrar resultados espúrios na população agrupada?

[11:39] Terceiro, -- bem, vou parar por aí. [Dr. Teri Manolio] Sim, por que você não para por aí? [risos] Voltaremos se pudermos. Então, quem gostaria de abordar essa? [Dr. David Hunter] Então, muito rapidamente -- quero dizer, claramente esta é uma grande preocupação. Você sabe, acho que o controle genômico e outros métodos nos dão alguma confiança de que podemos abordar isso estatisticamente, e qualquer um aconselharia que você colete informações autorrelatadas sobre ancestralidade, no entanto, isso seja definido, você sabe, país de origem ou qualquer outra coisa, para permitir que você se restrinja ou estratifique com base nessas informações.

[12:16] E então a outra coisa chave, obviamente, é que muitos desses estudos estão obviamente acontecendo em populações de ancestralidade europeia. Não há garantia de que esse SNP também estará associado ao mesmo fenótipo em outras ancestralidades. E isso tem que ser examinado cuidadosamente. E então, finalmente, à medida que os custos caem, à medida que os conjuntos de amostras aumentam, haverá associações que são privadas de populações particulares que só serão descobertas se olharmos nessas populações. [Orador Masculino] Apenas um comentário nesse sentido.

[12:48] Eu prefiro que algumas das pessoas que estão fazendo estudos GWAS deem importância a um conceito chamado Efeito Walland [soletrado foneticamente] em genética de populações. Mas há um conceito importante. [Dr. Teri Manolio] E talvez você pudesse tirar um segundo para explicar o que quer dizer com isso? [Orador Masculino] Efeito Walland -- há muito tempo, um geneticista de populações chamado Walland sugeriu que, ao colocar as -- assim chamadas misturar essas populações, isso afeta a espuriedade da frequência genotípica, e quando você usa essas frequências genotípicas elevadas, isso poderia afetar os estudos de associação.

[13:26] [Dr. Teri Manolio] Bem, e acho que -- você sabe, isso é amplamente reconhecido, e as pessoas estão considerando isso. Talvez estejam considerando um pouco demais, e talvez Laura comente. Mas o que temos tendido a fazer é focar em populações muito homogêneas, e um tanto em detrimento da capacidade de descrever o risco na população geral dos EUA. Laura? [Dr. Laura Scott] Então, há algumas coisas interessantes. Uma coisa que já comecei a ver acontecer é que, se diferentes grupos estão coletando amostras de casos e as comparando com amostras de controle existentes, quando você tenta fazer uma meta-análise, na verdade você não tem amostras independentes.

[14:06] E então, você terá que voltar e refazer a análise, seja de alguma forma alocando controles, ou levando em conta que você na verdade usou as mesmas amostras duas vezes. A outra coisa interessante de se pensar -- desculpe, isso está tendo um problema -- é que quando você tem estudos epidemiológicos que emparelharam variáveis particulares, como se você tivesse um estudo de diabetes tipo 2 que emparelhou pelo índice de massa corporal, o que estamos descobrindo é que às vezes genes que atuam para causar diabetes através do índice de massa corporal na verdade não podem ser encontrados naqueles estudos epidemiológicos que foram muito rigidamente emparelhados.

[14:49] E então, nesses casos, você pode na verdade ter vantagens em ter controles baseados na população. [Dr. Teri Manolio] Pontos muito bons. E só antes de Elizabeth, talvez eu possa perguntar à pessoa do AV se ele poderia gentilmente vir e colocar os slides da Laura, porque vamos apenas terminar aqui. E então o comentário de Elizabeth. [Dr. Elizabeth Pugh] Apenas -- David me fez uma pergunta e pensei em apenas mencioná-la. A pergunta era sobre amostras agrupadas. Então, uma possibilidade que as pessoas fizeram, especialmente antes que os custos de genotipagem começassem a cair, foi pegar um pool de casos e um pool de controles e comparar as frequências alélicas estimadas entre eles.

[15:26] Isso ainda está sendo feito. É um pouco desafiador tecnicamente, tanto em garantir que você tome muito cuidado ao construir o pool de DNA para que você tenha quantidades iguais de DNA de cada indivíduo, e então é um pouco complicado no que diz respeito à interpretação. Você não pode simplesmente executar um algoritmo de agrupamento de genotipagem e obter genótipos. Você tem que tentar estimar a proporção de cada uma das frequências genotípicas. Então ainda é possível. É certamente uma consideração, e é obviamente um custo orçamentário muito menor. Mas você precisa trabalhar com alguém que realmente saiba o que está fazendo tanto no lado do laboratório quanto no lado da análise.

[16:00] [Dr. Teri Manolio] Esse é um ponto excelente, e este foi um design de estudo que acho que foi usado inicialmente quando os custos de genotipagem eram muito altos. E é claro, outra desvantagem disso é que você não tem dados de genótipo individuais então para analisar -- você sabe, para olhar para suas pessoas muito interessantes.