Estudos de associação genômica ampla para o resto de nós: mesa-redonda 3

[0:00] [Dra. Teri Manolio] Então, à medida que as pessoas se aproximam do microfone, novamente, vou levantar uma questão com você, Nancy. Você poderia talvez descrever como podemos usar dados epidemiológicos para aprimorar as anotações que já temos? Quero dizer, levei muito tempo para aprender o que era uma anotação, como epidemiologista, então você poderia explicar isso. Você fez muito bem, mas então, como poderíamos usar alguns dados populacionais nisso? [Dra. Nancy Cox] Então, quero dizer, há -- acho que há coisas óbvias que vêm à tona imediatamente. Quero dizer, não sei como você poderia usar dados epidemiológicos para anotar SNPs, a não ser dizer que associações com outros fenótipos são uma anotação extremamente valiosa a se considerar, daqui para frente.

[0:43] Então, em algum momento, idealmente você insere uma lista de SNPs, sabe, de interesse porque surgiram em um estudo de câncer de pulmão, e tenta, sabe, entender. "Ok, sobre o que são esses SNPs?" E alguns deles podem ter surgido em outros fenótipos de câncer. Então isso se torna: "Ok, talvez seja um locus de suscetibilidade genérica à predisposição ao câncer." Talvez eles venham -- talvez, em vez disso, apareçam em estudos sobre asma, então é sobre função pulmonar ou desenvolvimento pulmonar.

[1:14] Quero dizer, então, acho que você começa a obter -- construir todo um conjunto de informações sobre polimorfismos quando começamos a pensar nas anotações não apenas como físicas, onde estão -- onde estão localizados, mas também, sabe, em que foram implicados, o que parece que preveem em termos de fenótipos? E uma coisa boa sobre isso é que é informação realmente útil mesmo se não estivermos olhando diretamente para o SNP causal, mas sim, ainda apenas pensando em correlações, porque um estudo de acompanhamento realmente importante será o re-sequenciamento profundo para tentar chegar a variantes causais reais.

[1:57] Debbie falou sobre parte disso. Mas para sequer saber, sabe, o que deveríamos re-sequenciar, acho que será realmente importante obter uma profundidade muito boa nas informações de anotação. [Dra. Laura Scott] Sim, acho que olhar através de múltiplas doenças é interessante mesmo fora de um tipo específico de doença. Então há um exemplo nos estudos de diabetes tipo 2 que foram publicados. Muitos deles encontraram associação com um locus que parece estar a montante de um gene chamado CDKN2A, e independentemente houve um estudo publicado sobre doença cardíaca que -- onde também há associação, mas o interessante é que não parece estar atuando através do diabetes.

[2:47] Parece que é um locus muito separado ali. Então você tem duas doenças diferentes no mesmo locus, o que faz você começar a se perguntar se o genoma não é na verdade um lugar muito pequeno. E se você tem uma probabilidade maior de que este também seja um locus realmente envolvido na suscetibilidade ao risco de câncer. Então, se você tem certos lugares no genoma onde, quando você tem variação, você simplesmente tem mais probabilidade de ter doença de qualquer tipo, acho que vai ser muito interessante ver.

[3:17] [Dra. Teri Manolio] Esse é um ponto muito bom de se destacar, que nós estamos na verdade -- como Laura disse, você sabe, embora o genoma seja um lugar muito grande, ele também está, de muitas maneiras, se tornando um lugar muito pequeno. E assim os artigos do Wellcome Trust publicaram uma associação entre uma determinada região, que agora esqueço, e diabetes tipo 1 que também era idêntica à mesma associação -- a mesma associação que foi encontrada na doença de Crohn. E quem diria? [Dra. Nancy Cox] E houve algumas para artrite reumatoide também que se sobrepuseram. [Dra. Teri Manolio] Sim, exatamente, então isso, eu acho, vai nos ajudar muito. Debbie?

[3:48] [Dra. Debbie Nickerson] Muitas vezes anotamos genes com base no que sabemos que eles funcionam. E na verdade não temos ideia de quantos processos diferentes no sistema. Temos 30,000 genes na verdade codificando uma máquina realmente complexa, se você quiser pensar assim. Essas coisas vão ser partes redundantes que são usadas de muitas maneiras diferentes, e pode ser através de estudos de associação que realmente teremos uma ideia de quão redundantemente elas são usadas. Elas também podem nos dar pistas sobre regiões do genoma que foram selecionadas ao longo do tempo, mais ou menos a hipótese do gene econômico, onde tivemos regiões que mostraram propriedades incomuns que nos protegeram em éons passados, mas hoje estão em frequências tão altas que agora estão causando doenças que realmente não tínhamos aparecendo na população há eras atrás.

[4:46] [Dra. Nancy Cox] Agora, o ponto da Debbie é realmente bom, e, quer dizer, até os nomes dos genes são um tanto históricos e às vezes quase enganosos. Então você verá coisas chamadas quinases porque têm um domínio quinase, e então pode acontecer que a forma alterada mais frequentemente observada -- você sabe, a forma processada desse gene nunca tenha o domínio quinase como parte dele. Então, você sabe, sua função principal pode ser algo que não é nada parecido com uma quinase, ou talvez seja.

[5:18] Quer dizer, esse é o problema, e o splicing alternativo certamente multiplica o número de produtos gênicos com os quais precisamos lidar em termos de estudos de associação também. [Dra. Teri Manolio] E o que é splicing alternativo? [Dra. Nancy Cox] Então, se você imaginar o conjunto linear de éxons que compõem um gene, frequentemente vemos que diferentes éxons são unidos para formar diferentes proteínas. E às vezes é uma diferenciação específica de tecido, então você pode ver os éxons um, três, cinco e sete expressos no fígado, e dois, quatro, seis e oito expressos no cérebro.

[5:58] E então, você sabe, diferentes subconjuntos dessa forma. Você pode simplesmente, sabe, remover o último éxon para alguma expressão em um momento diferente da vida, de modo que há diferenças temporais, às vezes diferenças específicas de tecido, e isso adiciona outra complexidade para descobrir qual é a função das associações que são examinadas. [Dra. Teri Manolio] Qual delas não vai realmente a partir da sequência, a partir dos dados de genotipagem.

[6:30] [Dra. Nancy Cox] Certo, e então o quê, você sabe, quando falamos sobre polimorfismos de sequência não codificante que se associam a doenças, alguns podem ser sobre sinais para splicing alternativo, alguns podem ser mais diretamente sobre a expressão daquele gene, e alguns podem ser sobre a expressão de genes, você sabe, a centenas de kb de distância que na estrutura secundária do DNA, você sabe, está meio que bem em cima do que há -- do que está funcionando. Então -- [Dra. Teri Manolio] Sim. [Palestrante feminina] Para imputar os dados, Mark Daly usou a frequência alélica, e Gonzalo Abecasis usou o genótipo, então acho que eles imputam os dados de forma um pouco diferente.

[7:12] Não é os 100 por cento -- como consistente com os dois métodos diferentes. Você sabe se são semelhantes -- eles funcionam ou se não estão funcionando de maneira semelhante? E como você pode lidar com o problema de inconsistência? [Dra. Laura Scott] Eu respondo essa. Então os métodos de imputação que mencionei de Jonathan Marchini e Gonzalo Abecasis estão olhando para os haplótipos faseados nos Dados do HapMap.

[7:47] Então a primeira coisa é, tanto no que Nancy quanto eu falamos, seu -- e o tipo de métodos multi-marcadores que surgiram do Broad, que eu acho que são semelhantes ao TUNA -- [Palestrante feminina] TUNA usa a frequência alélica. [Dra. Laura Scott] Certo. Certo. [Dra. Nancy Cox] É apenas estimar frequências alélicas. [Dra. Laura Scott] É estimar frequências alélicas. [Dra. Nancy Cox] Não é imputar genótipos diretamente. [Dra. Laura Scott] Certo, então você está começando com os mesmos dados subjacentes. Então, se você começou com os mesmos -- se você pegou a mesma porção de um haplótipo em ambos os métodos, então em teoria você deveria obter os mesmos resultados de ambos.

[8:24] O -- eu não sei até onde os dados de genótipo vão quando você está imputando no TUNA, mas nos métodos que aproveitam os dados faseados do HapMap, você está realmente aproveitando qualquer informação de LD que exista ao longo dos cromossomos. Então, meu palpite é que você pode estar obtendo uma estimativa um pouco mais precisa para os dados imputados do que para a estimativa de frequência alélica. Mas na maioria das vezes eles vão lhe dar resultados muito semelhantes -- semelhantes.

[8:58] A diferença aparece quando, se você quer fazer estudos de caso-controle onde você está olhando diferenças nas frequências alélicas, você obtém coisas muito semelhantes. Se você quer olhar características quantitativas, então você precisa ter os dados de genótipo individuais. E nesse ponto, as frequências alélicas não serão úteis para você. [Dra. Teri Manolio] Andy. [Dr. Andrew Singleton] Então eu me perguntei se valeria a pena discutir, brevemente, os problemas que a mistura, ou os problemas percebidos da mistura.

[9:30] Acho que há um reconhecimento geral de que a mistura não é um grande problema em populações caucasianas, quando olhamos para populações europeias. Mas claramente um ponto de interesse nos EUA é olhar para associações em coortes como afro-americanos, africano-asiáticos, pessoas da América do Sul que são miscigenadas com a população dos EUA. E eu me pergunto como isso afetará os resultados, e -- particularmente em relação aos métodos de imputação onde você está olhando para um genoma muito miscigenado.

[10:04] [Dra. Nancy Cox] Então estudamos muito os mexicanos-americanos e, você sabe, olhamos isso de várias perspectivas. E de fato -- então, você pode certamente usar estimativas de ancestralidade como covariáveis na análise, e também -- ou os componentes principais de algo como EIGENSTRAT. De fato, nos estudos -- em nossos estudos sobre mexicanos-americanos, eles são tão altamente correlacionados; não faz diferença qual você usa.

[10:35] A correlação para os primeiros componentes principais do EIGENSTRAT versus as estimativas de ancestralidade de algo mais baseado em genética de populações como o structure foi .95. Então, não fez diferença de que maneira você fez, e de fato, para o fenótipo que nos interessava, na verdade não fez diferença na análise, o que simplesmente implica que para aquele conjunto de dados em particular, não houve realmente uma grande diferença entre os casos e os controles que tínhamos, em termos de proporções de ancestralidade.

[11:12] Mas vai ser absolutamente possível fazer isso, eu acho, para -- seja você olhando para afro-americanos, mexicanos-americanos, outras populações de ancestralidade mista. Deve ser possível permitir as possibilidades de que os indivíduos não são identicamente miscigenados, e levar isso em conta nas análises. [Dra. Laura Scott] Eu quero voltar à questão sobre imputação porque acho que uma coisa que é muito importante, não importa qual método você esteja usando para fazer isso, é que se você está encontrando SNPs -- particularmente em uma região onde você não tinha nenhuma evidência de associação a partir de SNPs genotipados ou SNPs que parecem ter uma associação muito mais forte do que os SNPs genotipados -- é muito importante voltar e realmente genotipar esses SNPs na população original para verificar se a imputação está funcionando, porque se você faz imputação em todo um genoma e pega as associações mais fortes da

[12:13] imputação, há uma fração não desprezível que, ao serem re-genotipadas, terão uma associação mais fraca. Então você não pode simplesmente pegar os dados imputados e acreditar neles. [Dra. Debbie Nickerson] Eu gostaria de acrescentar um pouco a isso. Acho que a imputação para amostras europeias e asiáticas é -- pode ser tomada com -- pode -- é muito melhor do que a imputação para amostras de ascendência africana.

[12:45] Acho que há muito mais variação ausente nessa população na amostra do HapMap. Então, eu me preocupo um pouco em colapsar o conjunto de dados e usar imputações até sabermos muito mais sobre isso. Acho que a maneira como está sendo usado agora -- estamos olhando principalmente para pessoas de ancestralidade europeia para as quais temos um melhor controle da variação nos conjuntos de dados. [Dra. Nancy Cox] E você viu que, pelo menos em relação ao TUNA, nos mexicanos-americanos não tivemos uma correlação tão estreita quanto tivemos para as amostras europeias.

[13:25] No entanto, a correlação é muito boa. E então, acho que é apenas uma medida -- uma medida adicional de incerteza para isso -- para populações fora do HapMap. E é claro, há uma variedade -- então imputamos usando cromossomos europeus e asiáticos nos mexicanos-americanos. E para muitos SNPs que têm frequências muito semelhantes nas duas populações, você obtém exatamente os mesmos resultados com o TUNA, independentemente de você estar olhando dentro dos asiáticos ou dos europeus.

[14:01] Mas para uma proporção considerável de SNPs, você só obtém uma resposta em uma população ou na outra porque o SNP simplesmente não é polimórfico em europeus, por exemplo, mas apenas em japoneses e chineses. Ou, é apenas -- apenas informativo no subconjunto europeu. Então há algumas diferenças muito interessantes. E acho que, você sabe, você quer levar em conta, mais ou menos, ancestralidade local versus global ao tentar interpretar algumas dessas coisas.

[14:32] [Dra. Laura Scott] Então nos -- nos -- com os programas de imputação, eu sei que uma das coisas que foi tentada é na verdade pegar todos os cromossomos do HapMap e usá-los como seu conjunto inicial. E se estou me lembrando corretamente dos slides que vi, isso na verdade faz um trabalho muito bom na maioria das populações, mesmo aquelas que são -- você sabe, se você pegar um painel dessas populações de todo o mundo, ele faz um trabalho melhor em algumas delas, ou um trabalho igualmente bom, do que pegar qualquer um dos três específicos do HapMap -- origem europeia, africana e asiática.

[15:17] [Dra. Teri Manolio] Outro comentário, Debbie? Último comentário. [Dra. Debbie Nickerson] Você sabe, o -- eu acredito que o -- ainda deve ser usado com cautela no conjunto de dados africano que é subestimado nos chips e subestimado no HapMap.